Western Blot实验原理/流程
解决三个问题
1. 什么是WB？
2. 为什么是WB？
3. 怎么做WB ？
（详情见右上角资料下载）
1. 什么是WB？
Western Blotting，即免疫印迹 ，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，它结合了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的特异性 。
其基本原理是：通过电泳将蛋白组分分开 ，然后将电泳后凝胶上的蛋白质转移至载体膜上，用封闭试剂封闭载体膜上未吸附蛋白质的区域 ，最后通过免疫学检测来分析特定的蛋白质表达水平。
2. 为什么是WB ？
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其分辨率和灵敏度 ，广泛地应用于检测特定基因表达产物的正确性，或者比较表达产物的相对变化量 。
3. 怎么做WB？
3.1 实验前准备
实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材 ，主要包括：
各种凝胶配置液、各种缓冲液、相关抗体、PVDF膜，赛默飞公司的QSP 盒装吸头及 Nunc 冰盒 ，芬兰百得的各个量程单通 道移液器等。
主要仪器有：Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪 、离心机、电泳
仪等。
3.2 实验流程
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先制备蛋白样品，然后进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，将电泳后凝胶上的蛋白质转移至 PVDF 膜上 ，接着 对含有蛋白质的 PVDF 膜进 行免疫学检测 ， X-胶片显影定影后 ，扫描图片 ，最后用 IPWIN6.0 软件 分析结果 。
3.2.1 蛋白样品的制备
蛋白样品一般来源于基因工程菌或特定的真核细胞，本实验以单层贴壁细胞总蛋白的提取为例 。
(1) 按 1ml 裂解液加 10 μl 的 100 mmol PMSF ，混匀后置于冰上待用。注意 PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合 ， PMSF 是剧毒物质，操作时要谨慎 。
(2) 倒掉离心管中的上清，用移液枪吸去残余培养注意不要走细胞。
(3) 每管细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min ，为使细胞充分裂
解，要经常上下颠倒离心管 。
(4) 然后于 4℃ 10000 ×g离心力离心离心力离心5min 。将离心后的上清分装转移至干净的离心管中 ，分装至少两份 ，放于-80 ℃保 存 。
(5) 蛋白质定量：按 BCABCA蛋白质定量试剂盒操作说明进行，用 Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪于波长 562 nm 处检测 OD 值 ，绘制标准曲 线并 计算样品蛋白浓度 ，取适量上清，加入上样缓冲液，煮沸计算样品蛋白浓度，取适量上清，加入上样缓冲液 ，煮沸10 min 。缓慢恢复。缓慢恢复至室温后，稍离心放于 -20 °C 保存 。
3.2.2 SDS-PAGE电泳
（1）凝胶的制备
灌胶前，需组装好制胶器，将洗净且干燥的两块玻璃板底端对齐后安放在灌胶支架上 。
a.参照 12% 分离胶配制体系依次加入各个组分，混匀。将配置好的凝胶 ，沿玻分离胶配制体系依次加入各个组分 ，混匀。将配置好的凝胶，沿玻璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡。根据梳子深度确定灌制高度，通常距璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡 。根据梳子深度确定灌制高度，通常距离矮板至少 2cm ，灌好后注入水封胶 。
此时可按照配方制 5% 浓缩胶 ，注意 TEMEDTEMED在灌胶前再加入。
(注意： AP 最好在配一周内使用 ， TEMED 避光保存，分离胶和浓缩的 Tris Tris pH值分别是 8.8 和 6.8 )
b.静置一段时间待凝胶聚合 ，后弃去封溶液并用吸水纸干 。
c.往浓缩胶里加入适量 TEMED ，混匀后缓慢灌入到胶槽至矮板顶部，插上梳，混匀后缓慢灌入到胶槽至矮板顶部，插上梳子 ，操作时避免产生气 泡。
d.静置一段时间至凝胶聚合，拔下梳子用蒸馏水冲洗孔。
此时制好的胶可进行后续实验。
（2）上样及电泳
a. 安装电泳槽，注意确保内槽不漏缓冲液，往电泳槽加入足量电泳缓冲液，缓冲液要没过玻璃板和凝胶。
b. 吸取适量样品或者分子标准 MarkerMarker ，缓慢加入至胶孔。 ，缓慢加入至胶孔 。注意：加样太快会注意：加样太快会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时，要注意更使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时 ，要注意更换枪头，以免交叉污染。
c. 上样完毕后，盖上电泳槽盖子，接通电源，设置电泳条件，一般浓缩胶15 mA ， 分离胶 20 mA ，或恒压 100 -120 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可关闭电泳。电泳至溴酚兰刚跑出即可关闭电泳仪停止电 泳。
3.2.3 转膜
(1) 将玻璃板从电泳槽中取出 ，用塑料切胶器在玻璃板的两边轻轻撬动，至到小玻璃板开始松动。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，注意不要把分离胶刮破。玻璃板开始松动 。除去小玻璃板后 ，将浓缩胶轻轻刮去，注意不要把分离胶刮破 。将剥出的胶浸于纯水中 5min ，重复三次后放在转膜液中浸泡 10 min 。
(2) PVDF膜预先用甲醇浸泡膜预先用甲醇浸泡5min ，然后将转印膜、迹滤纸和海绵垫浸泡于 转移缓冲液中 10 min 。膜和印迹滤纸的大小应裁剪至与胶的大小相当。在黑色面。膜和印迹滤纸的大小应裁剪至与胶的大小相当 。在黑色面板上放置一层海绵垫，并依次至少 3层印迹滤纸，凝胶转膜和至少 3层印迹滤纸。
放置膜时尽量一次性准确放置，凝胶与转印膜一旦接触就不要再移动，并记住膜与胶的接触面 。 玻璃试管轻滚压滤纸挤出气泡用海绵覆盖关上转印夹，合上锁扣 。安装好的转印夹应该使胶紧密地与PVDFPVDF膜接触而不被膜接触而不被挤压 。
(3) 将组装好的夹子装入转移电泳槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面。添加电泳缓冲液，盖好子开启电泳仪设置条件一般用 200 mA mA 1-2h ，或用恒 压 100 V 1-2h。注意 ：电泳转移时会产热，需要在电泳槽的一边放一些冰来降温。。注意：电泳转移时会产热，需要在电泳槽的一边放一些冰来降温 。
转膜完成后，就进入免疫反应 。
3.2.4 免疫反应
印迹后的 PVDFPVDF膜用 5% 脱脂奶粉溶液室温孵育封闭１ h，也可在 4℃过夜。
将抗 Caspase 3aspase 3的鼠 源单克隆抗体用一抗稀释液稀释至适当浓度，室温下孵源单克隆抗体用一抗稀释液稀释至适当浓度，室温下孵育 PVDFPVDF膜 1-2h后，用后，用TBSTTBST在室温下脱色摇床上洗在室温下脱色摇床上洗3次 ，每10 min ，再用 TBSTBS洗一次， 10 min 。
将过氧化物酶标记的 羊抗鼠二或 X GX GAPDH 抗体按照适当比例用 TBSTBS稀 释，室温下孵育 PVDFPVDF膜 30 min 至 1h
用 TBSTTBST于室温下脱色摇床上洗 3次，每次次 ，每次10 min ；再用；再用TBSTBS洗一次， 10 min 。
3.2.5 ECL化学发光与X光片定影
加入显色底物后按常规 X光片显影方法将转印膜上的信号移至 X光片上。光片上。
3.2.6 半定量结果分析
将定影后的 X光片扫描保存为电脑文件 ，并用 IPWIN 6.0IPWIN 6.0分析软件 对图片上每个特异条带灰度值进行数字化分析 。
具体操作如下：打开 ImaImage Pro Pluse Pro Plus软件 ，点击 FileFile ，打开结果图片 。，打开结果图片。
（1）首先进行光密度校对，点击MeasureMeasure ，CalibrationCalibration ，点击，点击IntensityIntensity。在 Intensity Intensity CalibrationCalibration窗口中，点击窗口中，点击NewNew，选中，选中Std.Optical DensityStd.Optical Density，点击，点击OpticalOptical ，点击，点击ImaImax ge，选择图中最亮的一点。然后点击 ，选择图中最亮的一点。然后点击Ok，依次在新出现的对话框中点击 ，依次在新出现的对话框中点击Ok， Systemystem ，然后关闭小对话框。 ，然后关闭小对话框。 点击 Measureeasure，Count/ount/Sizeize ，点击，点击Select elect Color ，Color Cube ube Basedased ，使用滴管，使用滴管将要分析的条带覆盖成红色 ，即将要分析的条带覆盖成红色 ，即AOIAOI，关闭窗口。点击 ，关闭窗口 。点击Measureeasure ，Select elect Measureeasure ， 选择 Arearea和 IODIOD 。在 Count/SizeCount/Size窗口中，点击 Options 。Label StyleLabel Style选择 Measurementeasurement ，可选择将 ，可选择将AreaArea或是 IODIOD的值显示在各的值显示在各AOIAOI上 。点击上。点击Ok ，点击 Count ，即得到各，即得到各AOIAOI的 IODIOD值 。点击值 。点击Viewiew，Measurement easurement Dataata，可见每个，可见每个AOIAOI对应的面积和累光密度值 。在 Statisticstatistics窗口可查看面积和光密度的总值 。窗口可查看面积和光密度的总值 。
（2）接下来进行数据处理：样品中目的蛋白的IODIOD值除以内参 X GAPDHX GAPDH 的 IODIOD值，所得结果代表某样品目的蛋白相对含量。
利用此软件 ，可以对一系列的梯度条带进行数字化分析和处理，如内参为X GAPDHGAPDH的 CXCR fourCXCR four的分析，内参为 β-Actinctin的 Caspase Caspase 3的分析等 。的分析等 。