713贵宾会检测线路


    搜索查找太麻烦 ?在713贵宾会检测线路的热门提问里找找吧HOT
    • 为什么在713贵宾会检测线路官网输入某些购买过的抗体【货号】搜索不到对应产品了?

            713贵宾会检测线路生物会不间断的进行产品应用验证和产品线梳理,下架原因一般有如下情况 :

      (1)对于某一应用检测不合格的产品,713贵宾会检测线路将下架该产品的该应用;

      (2)对于多个应用的多轮检测仍不合格的产品 ,713贵宾会检测线路将直接下架该货号;

      (3)通过多轮验证后的产品,出现了反应种属、应用和功能的重复 ,例如A货号与B货号产品的反应种属和应用完全相同 、宿主相同、性能相同 ,则713贵宾会检测线路将会择其一进行下架 ,减少客户选择产品的难度 ;

      (4)某一货号产品销量极少 ,即将过保时。


    • 如何选择合适的二抗 ?

          二抗,又名“secondary antibody”,常出现在需要使用一抗的免疫实验中 。

          按照功能可分为常规标记二抗和荧光二抗两种 。二抗的结合对象为一抗,其以一抗本身 (如兔IgG)为靶标 ,通常在产品名称中用类似“Goat Anti-Rabbit(即山羊抗兔)”来标识靶标识别关系。以“Goat Anti-Rabbit(即山羊抗兔)”为例,“Goat-山羊”为二抗的抗体来源种属(即“宿主”),“Rabbit-兔”为二抗所要结合的一抗的抗体来源种属。

          当某一免疫反应体系中的一抗来源为“Mouse-小鼠”时,即可选用“Goat Anti-Mouse”或“Rabbit Anti-Mouse”等二抗来完成反应。

          二抗与一抗的抗体来源种属 ,应保持不同,以避免抗体内自相反应 。

          


    • WB最后结果——膜上一片空白?

             未出现阳性信号是抗体相关实验的常见问题,常出现的有WB实验曝光后膜上一片空白等现象,需要根据具体的情况进行分析:

      一、确认检测靶点在样本中的表达情况

             一般来说,常见的蛋白可以在基因注释查询网站——BioGPS中进行查询 。但应注意,该网站罗列的是基因对应编码蛋白在转录水平上的表达量。该表达量会与实际翻译产生的蛋白水平会有出入,仅能作为参考。低表达量的蛋白,在能检测到的情况下,可以提高抗体的稀释浓度来改善 。

             分泌型蛋白在细胞的正常表达中,会分泌到细胞外,胞内残留的蛋白含量比较少 ,这种时候,建议用含有蛋白的阳性样本(比如组织)作为对照进行比对 ,判断是蛋白含量低还是抗体特异性的问题 。

      磷酸化蛋白,以及一部分蛋白 ,需要进行药物的刺激,才能在样本中高表达,这种情况下,一般客户可能没有阳性样本,需要客户提供参考文献作为说明 ,713贵宾会检测线路根据参考文献中的具体报道,进行问题的判明。有时候,客户会忽视文献中样本的处理步骤,导致反馈的产生。


      二、样本制备的问题

             虽然很多时候 ,冻融过的样本可以进行重复  ,但是仍然有蛋白(例如小分子蛋白,分泌型蛋白等),在冻融之后会大量降解,使得先前可以做出来的结果,无法重复,这种时候,713贵宾会检测线路一般会建议客户进行新鲜样本 的制备和检测。

             在裂解细胞或者组织时 ,选择合适的裂解液也十分重要,常见的RIPA裂解液适用广泛,但是对于膜蛋白或者核蛋白 ,713贵宾会检测线路建议用专门提取此类蛋白的protocol进行样本制备,以达到目的蛋白的大量收集 。


      三、实验操作不当

             小分子蛋白极易降解,且吸附能力 。转膜时应使用0.2μm的PVDF膜,并将甲醇浓度维持在20%,增强小分子蛋白在膜上的结合能力。转膜条件可设定为80v/1h,即使用较低的电压和适当的转膜时间。

             对于分子量约10kd左右的某些分泌型蛋白 ,这类蛋白在电泳时极易弥散,导致抗体无法检测,出现没有信号的情况,小分子蛋白的实验操作可以进行优化,条件如下 :

             1. 配置SDS-PAGE胶时,加大浓缩胶的比例 ,使得浓缩胶:分离胶约为4:6,甚至可以5 :5,这样可以让小分子蛋白在浓缩胶中充分的浓缩 ,在后续的分离胶实验中,减少弥散程度 。

             2. 电泳时 ,以80v电压进行压缩,时间约为40min ,电泳至两种胶的界面。然后,将电压调整到100v,在12%-15%的分离胶中进行电泳,跑到分离胶一半的位置 ,一般10kd的marker能够分开就可以了,目的是避免长时间的电泳使得小分子蛋白弥散。(这种时候可能内参就不好检测了,但是为了检测出小分子蛋白,还是跑另一块胶检测内参吧)

             3. 在转膜的时候,不要在转膜液中加入SDS,防止小分子蛋白与PVDF膜无法结合 ,可以将甲醇的浓度提升至30%,增强小分子蛋白与膜的结合。

             4. 对于10kd左右的蛋白 ,转膜条件80v,30min就可以将蛋白转印 ,最多不超过60min,只要marker成功转移到膜上,相应的分子量就转移过去了。

             大分子蛋白在电泳时,使用6%-8%的分离胶,200kd以上建议6%进行分离,转膜时胶比较软 ,轻拿轻放。同时,需要降低甲醇的浓度,10%即可,为了防止蛋白在凝胶中形成沉淀,可以在转膜时加入终浓度0.1%的SDS,条件为80v ,根据蛋白的大小,3h-5h ,甚至更久的转膜时间都是可取的,对于200kd以上的蛋白 ,建议20v,在4℃转膜O/N,可以得到比较好的效果 。

             封闭时 ,过长的封闭时间可能造成过度封闭使靶点结合抗体效率降低 ,洗膜也不宜过度,防止洗脱结合的蛋白 。

             大包装抗体,或者长期储存的抗体,由于静置时间过久,甘油可能分层,浮在表面。在稀释抗体时,可能会造成吸不到抗体的情况 ,每次使用建议瞬时离心,将甘油离心到管底,吸取上层保存液使用 ,避免这种情况的发生。


    • Marker居然出现阳性信号!我该怎么解决?

             由于多克隆抗体识别的抗原表位比较多,预染Marker的本质也是多种分子量不同的融合蛋白 ,多克隆抗体可能会识别这些蛋白,从而在显影时出现信号 。一般来说单克隆抗体可以解决一定程度的问题,但是在多克隆抗体识别出特异性抗原的情况下,可能会影响信号的显影,713贵宾会检测线路建议裁掉Marker,加强目的条带的曝光程度。

      Marker有信号,怎么解决?

    微信扫码关注
    Copyright ©2022 - 2023 成都713贵宾会检测线路生物技术有限责任公司
    犀牛云提供企业云服务

    XML地图